从PD-1到CART,抗癌新时代的到来

 

《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为2013年十大科学突破的首位,并预测2015年重要突破之一是联合免疫疗法。


【免疫检查点阻断药物】


基于免疫检查点阻断原理的试验药物大获成功,被称为2013年度肿瘤医学界最激动人心的进展。也给广大病患带来新希望。这些药物包括针对PD-1的nivolumab、MK-3475、pembrolizumab,针对PD-L1的MPDL3280A、MEDI4736,针对CTLA4的Ipilimumab,等。

PD-1是程序化死亡受体。PD-L1是程序化死亡配体。两者在T细胞和肿瘤细胞均有表达。肿瘤细胞通过PD-L1触发PD-1,导致T细胞的失活。将人单克隆抗体用于封闭PD-1,或封闭PD-L1,结果PD-L1将无法触发PD-1,从而强化了T细胞的战斗力。

据报道,免疫检查点抑制剂的总缓解率为20%左右。与PD-L1表达阴性的患者相比,PD-L1表达阳性的患者的缓解率较高(13%vs36%)。

PD-L1是PD-1的配体,因此抗PD-L1的单克隆抗体是同等重要的免疫检查点抑制剂。有证据表明抗PD-L1抑制剂的耐受性相比PD-1抑制剂可能会更好。估计原因是PD-1抑制剂封闭了T细胞上的PD-1。PD-1既然是正常的受体,?#26434;?#23384;在的理由。现在人为封闭PD-1,在影响癌细胞的同时,也会影响到PD-1的正常生物功能。PD-L1抑制剂针对癌细胞,不会影响到T细胞上PD-1的正常生物功能。

现在探讨免疫检查点抑制剂的特点

这类抑制剂的最主要特点是广谱性。T细胞只要激活,能攻击各种癌细胞,因此一种药对多种肿瘤具有疗效。

第二是良好的耐受性。启动的T细胞具有特异性,只针对癌细胞,完全没有传统治疗(手术、化疗、放疗)的杀敌一千,自伤八百的弊端。毕竟T细胞早已在胸腺中学会认识正常细胞,不太会误伤自己人。至多是杀敌一千,自伤八十吧。

第三是可以长期有效。每2到3星期一次的治疗,由于良好的耐受性,可一直?#20013;?#19979;去。相比之下,化疗、放疗由于对正常组织伤害大,难以长期维持。被T细胞杀伤的癌细胞?#21040;?#21518;提供了新抗原,保证了过继免疫的?#20013;?#24212;答,形成了良性循环。

接下来探讨免疫检查点阻断疗法的局限性

首先注意到平均缓解率只有20%几,似乎有70%多的患者未受益。这取决于过继免疫应答(细胞毒T细胞的免疫应答)是否存在以及应答有多强。可分4种情形。

一是T细胞与癌细胞棋逢对手,难分上下,免疫检查点阻断就有可能成为压垮骆驼的那根稻草。

二是T细胞弱于癌细胞,但相差不太多。免疫检查点抑制剂?#26434;?#21487;能助T细胞反败为胜。

三是过继免疫应答太弱,免疫药物助阵也无法逆转战局。

四是免疫耐受、免疫衰竭,过继免疫应答不存在或已熄火,T细胞将癌细胞?#24330;?#20102;一家人,免疫检查点阻断疗法是无效的。好比警察不识恐怖分子,给再多的武器也无用。

?#27604;?#20063;可能存在第五种情形,过继免疫应答已非常强大,不用借助外力也能压制癌细胞。?#26434;?#23601;属于这类情形,往往被视为奇迹。如果?#26434;?#32773;正好试着某一偏方、食疗、功法,多半会被推崇备至,以为仙方神功。这大概是网上疯传的众多偏方、食疗、功法的起源吧。

70%多未缓解的患者,要么已经免疫耐受,这是最糟糕的一种情形;要么过继免疫应答太弱,免疫药物助阵也无法逆转战局。不过,无法逆转战局不等于未受益,疾病的进展还是受到了部分阻击,只是?#27605;?#21307;学手段无法精确检测出,也无法对比。

从PD-L1表达阳性的患者三分之一多的缓解率可以大致推测总群体里至少有相同比率的患者,无论是阴性阳性,属于第一、二种情形。阴性导致外来助力打了折扣,影响了治疗效果。外因还是要通过内因起作用的。

一个大家都关心的问题是长期使用免疫检查点阻断药物最终会否导致耐药。目?#21543;形?#35265;到这方面的报道。根据选择压力以及癌细胞的异质性,耐药的可能性或许存在。PD-L1高表达/过表达的癌细胞有较多的机会躲过T细胞的扫荡,形成免疫?#21491;?#26666;,逐渐增殖成为肿瘤的主流。需要更多的单克隆抗体来封闭PD-L1。这与PD-L1表达阳性的患者的缓解率较高的临床结果并不矛盾。同样是第一种情形,PD-L1表达阳性患者的过继免疫应答应该强于PD-L1表达阴性患者,才能到达动态平衡。封闭等同量PD-L1之后,?#25239;?#32487;免疫应答能杀伤更多的癌细胞。

最后探讨强化免疫检查点阻断疗法的可能性

最直接的是强化现存的过继免疫应答。可以通过白介素-2促进免疫效应T细胞的增?#24120;?#30333;介素-12等细胞因子促进T细胞的分化,伽马干扰素提升免疫细胞的活力,等等。DC-CIK或许也?#24515;?#20040;一点作用?

针对免疫衰竭,有报道少量的放化疗能造成抗原的大量产生,再次激活过继免疫应答。类似内毒素的双链RNA,细菌特异的DNA,多糖,脂多糖等等也有可能刺激免疫细胞的陀样受体释放白介素-12等细胞因子【1】。

结论

怎样启动、强化、检测过继免疫应答仍是医学界的一大难题。如?#26410;?#30772;免疫耐受,更是医学领域难中之难。

免疫系统的机理极其复杂,是一个交叉作用的超级网络。各种受体、配体、补体,各种抗原、抗体,各种细胞因子,各种免疫细胞,多态HLA分子,以及多个免疫器官相互作用。仅细胞因子就有两百余种,很多具有双向调节作用。例如,白介素-2参与正反调控,不仅促进免疫效应细胞如CD8+,同时也促进调节性T细胞的增殖。而调节性T细胞的上调会抑制免疫效应细胞。究竟是促进还是促退,还?#27599;?#21035;的因素。这也是早期LAK免疫疗法不成功的原因之一。

免疫检查点阻断药物基于过继免疫应答,可这免疫应答不是我们能掌控的。我们的免疫系统处理外源性病原体效率高,偏偏对肿瘤不是很?#31185;住?#27604;如,根据危险模型理论【2】,免疫系统多半是不识肿瘤的,因为肿瘤是自己身体里长出来的,属自家人。如果?#31185;祝?#20813;疫系统就不会坐视单个癌细胞发展到千千万万个。单个癌细胞都没能消灭掉,要对付千千万万个癌细胞自然要难上千万倍。所以每个?#26434;?#30340;都是奇迹。

过继免疫应答的启动需要一系列条件。最重要的是要有明确可识的抗原,为第一信号。其次需要T细胞和抗原提呈细胞APC相互刺激产生共刺激信号,为第二信号。根据危险模型理论,针对肿瘤还需要危险信号,为第三信号。可是医学界?#24418;?#25214;到产生这三种信号的有效手段。此外,某些癌细胞的主要组织相容性复合体MHC表达过低,也会造成免疫细胞?#20063;?#21040;肿瘤相关抗原。

嵌合抗原受体T细胞疗法CART,绕过了启动过继免疫应答这一难关,开创了跨越式发展的医学史新篇?#38534;?/span>

最后提一下,PD-L1表达阴性也不必气馁,塞翁失马,焉知非福。有报道,肿瘤细胞PD-L1高表达的患者抗VEGF治疗效果?#24739;眩?#24635;生存期更短。如此一来,PD-L1阴性的患者用血管生成抑制?#30103;?#19981;是更有把握了。又有报道【3】,Genentech在分析抗肿瘤PD-L1抗体MPDL3280A的治疗结果时有了意外发现肿瘤PD-L1阳性的响应率为38%,而肿瘤浸润免疫细胞PD-L1阳性的响应率为83%!Genentech的观点是,抑制免疫应答的不是肿瘤细胞而是在肿瘤微环境中的免疫细胞自身。真有意?#36857;?/span>


【嵌合抗原受体T细胞疗法CART】


什么是CART

CART的概念是以色列Zelig Eshhar博?#21487;?#19990;纪80年代提出的,1989首次开发出嵌合抗原受体T细胞。

CART针对那不怎么?#31185;?#30340;过继免疫,引入全新的概念与方法,成功地诱导出抗癌的过继免疫应答。

首先CART解决了抗原的难题。既然在自然的状况下免疫系统?#20063;?#21040;抗原,那就人为?#20184;?#19968;种抗原。考察急性淋巴B细胞白血病的CART疗法。淋巴B细胞表面有一个分化抗原CD19,无论是正常B细胞还是癌变B细胞?#21152;?#34920;达。选CD19为靶抗原可以确保没?#26032;?#32593;之鱼。

接下来,怎样确保T细胞能找到CD19靶抗原?这也是CART的核心技术。自然的T细胞肯定不会将CD19?#24330;?#38774;抗原的。CD19表达于正常B细胞,T细胞对CD19耐受。CART将一个抗原受体嵌合到T细胞表面。这抗原受体?#23616;?#26159;一种抗体,对CD19有很高的亲和性。两者碰到?#31361;?#32467;合,不离不弃。于是,用抗体蛋白联接定位,T细胞就钉住了癌细胞。所以有一比喻,这抗原受体就像GPS,给T细胞导航,为找到目标提供了保证。

嵌合抗原受体T细胞疗法就是嵌合了抗原受体(CAR)的T细胞疗法。

那抗体又是怎样插入进T细胞的?这是通过基因转染技术实现的。这里转染的并不是抗体本身而是编码抗体的基因,也就是说转染的是DNA。转染的DNA会编码抗体?#32531;?#34920;达于T细胞表面。

仅仅嵌合了抗体的T细胞疗法是第一代CART,解决了靶抗原或第一信号的问题。但是临床效果差強人意,原因是第二信号即共刺激信号的缺失。没有共刺激信号T细胞仍然没法激活,那样就算钉住了癌细胞也没有战斗力。产生共刺激信号需要T细胞和抗原提呈细胞之间的互动。可是抗原提呈细胞也需要第一信号。这样势必还要将同样的抗体嵌合进抗原提呈细胞如DC,过于复杂了。

于是,针对共刺激信号又开发出第二代CART。第二代CART在靶向CD19的基础?#24076;?#21152;入了CD28或CD137,T细胞上的共刺激受体。T细胞的信号域包括:CD3ζ(T细胞抗原受体信号转导的组成成分)——CD28,或CD3ζ——CD137。免疫应答的贯序可表述为:CD19激活抗体,抗体激活CD28(CD137),CD28(CD137)激活CD3ζ。可以说,第二代CART同时解决了第一信号和第二信号,不再依赖不怎么?#31185;?#30340;肿瘤相关抗原,不再依赖抗原提呈细胞,也不必担心MHC的低表达。

第三代CART的特点是在CD28之后又加入了共刺激分子蛋白OX40或4-1BB(4-1BB就是CD137)。这两种共刺激分子蛋白可进一步活化T细胞,延长生存期。三代CART技术的演化?#20174;?#20102;共刺激分子的重要作用。

在此小结一?#38534;?#23884;合抗原受体CAR能与靶抗原高亲和性结合而不受中枢耐受的影响,这一特性使得CAR的免疫治疗能够克服以往免疫治疗的大部分?#27605;蕁?#22240;为大部分CAR由单链受体来源的胞外域组成,因此能够以不依赖MHC的方式识别肿瘤表面的靶抗原,克服了肿瘤?#21491;?#26426;制,如MHC表达下调或抗原呈递装置功能?#27605;蕁?#36825;一特性使得CAR表达细胞去攻击低免疫原性的肿瘤。

急性淋巴B细胞白血病的CART疗法获得?#21496;?#20154;的90%-100%的响应率,长期有效,不少病患完全缓解也就是临床痊愈了。更何况,这些入组CART的病患都是化疗失败、骨髓移植后复发等就快走投无?#20998;?#30149;患。CART将会成为人类历史上伟大里程碑:真正治愈癌症的方法。

CART疗法的安全性与对策

推广CART疗法的主要障碍来自脱靶效应。像CD19不是肿瘤的靶点,而是B细胞本身的靶点。肿瘤细胞清除掉的同时B细胞也被清除掉了。这已不是杀敌一千,自伤八百。更不是杀敌一千,自伤八十。而是宁可错杀一千,绝不放过一个。好在患者没有B细胞照样可以生存,只要定期输入丙种免疫球蛋?#20934;?#21487;。

只要靶点不是百分百肿瘤特异性,?#31361;?#26377;脱靶效应,这是CART?#24330;?#29992;的主要来?#30784;?#25454;报道,一例以HER2为靶抗原针对结肠癌的第三代CART治疗,病人输入CART十五分钟后出现呼吸窘迫,五天后死亡。检测到高水平的细胞因子并发现CART细胞浸润肺组织。一个解释是靶抗原在正常肺组织中有表达。

为了提高CART治疗安全性和有效性,一个保守的剂量递增方法是在2天或以上分散T细胞输入剂量,不断监测毒性迹象,阻止可能诱发大规模?#20174;?#30340;进一步T细胞输入。用单克隆抗体封闭靶抗原来缓解脱靶?#20174;?#20063;是必要时的一种选择。最近还提出了引入自杀基因的方?#31119;?#24517;要时立即启动CART自杀,目前在III期临床试验。

CART疗法另一?#24330;?#29992;是细胞因子风暴。据报道早期CART治疗时60%的病患要住ICU。现在用剂量递增方法可大大减少细胞因子风暴的产生。

肺的CART疗法

到目前为止大多数临床CART引人注目的结果都来自治疗血液疾病。针对实体瘤的CART临床也开?#35745;?#27493;【4】【5】。

重中之重是找到一个合适的靶抗原。一个合适的靶抗原最好是只表达于肿瘤,也就是肿瘤特异性抗原。但是迄今为止肺肿瘤中未找到这样的特异性靶抗原。这也是过去十年肺肿瘤疫苗接二连三走麦城的主要原因。也说明肺癌细胞更容易逃避免疫监视。

于是只能退而求其次寻求肿瘤相关性抗原。我们寄希望于靶抗原在肿瘤细胞中高表达,在正常细胞中低表达。目?#20843;?#21457;现的肿瘤相关抗原绝大多数均是机体自身的成分,只是在正常情况下正常组织不表达或微量表达,或表达局限在某一(几)类组织或细胞。而肿瘤细胞中过量表达。因此,这类免疫细胞治疗也存在发生自身免疫?#20174;?#30340;风险。

一个能想到的靶抗原是癌胚抗原CEA。不少肺癌患者CEA远高于正常?#25285;?#35828;明癌胚抗原多半高表达。在自然情况下,高表达的癌胚抗原难以启动过继免疫应答。这是因为癌胚抗原曾在婴儿体内高表达过,容?#33258;?#25104;免疫细胞对癌胚抗原终身耐受。有了CART,免疫耐受不再成为问题。但不知什么原因,以癌胚抗原为靶抗原的CART临床试验目前只有乳癌与肠癌。或许,癌胚抗原高表达在乳癌与肠癌患者中比率更高。

另一个我们能想到的是EGFR(HER1),我们的老朋?#36873;?#30001;于EGFR在众多器官组织中表达,我们希望EGFR在肿瘤细胞中的表达远高于正常细胞,CART就有施展空间。将EGFR表达分成四级:阴性、弱阳性、中阳性、强阳性。EGFR基因突变不一定EGFR?#31361;?#38451;性表达。有意思的是,据报道【6】EGFR表达阳性的比例远高于EGFR基因突变,130例NSCLC中突变率为29.2%。EGFR阳性率为67.7%。因此,EGFR野生的也有很高的几?#26102;?#36798;阳性,有希望接受CART治疗。值得注意的是,15%的正常组织呈弱阳性,而三分之一的癌变组织呈阴性。因此脱靶的可能性存在。接受CART治疗前做免疫组化,或许应该同时检测癌变组织和正常组织。如果正常组织呈弱阳性,癌变组织最好要?#26159;?#38451;性。

HER2也是一个可能的靶抗原。由免疫组化确定表达水平,以?#21496;?#23450;是否可上CART疗法。

接下来介绍肺CART治疗的医院。令人意外的是,能找到的基于HER1和HER2的肺CART临床试验都在301医院,另有一家用HER2【5】。部队医院真是敢想敢干,走在世界前列。临床设计的主要终点是安全性,次要终点是抗瘤应答率。根据美国临床试验注册官网【4】描述: anti-EGFR-CAR (coupled with CD137 and CD3 zeta signalling domains) vector-transduced autologous T cells on days 0, 1, and 2 in the absence of unacceptable toxicity,至少可以确定是第二代CART,分三天回输经基因工程转染的T细胞以确保无毒性。 

觉得301的临床实验的设计较合理: 专注靶抗原的表达水平而不?#24515;?#20110;特定的病理组织形态。因此,301医院的CART-EGFR同时面向肺癌、肠癌、卵巢癌、肝癌等阳性表达的实体瘤。以?#27515;?#25512;,CART-CEA也可如此设计,不限于某一类癌症,只要CEA表达阳性即可CART治疗。

CART同样存在长期使用会否导致最终失效的疑问。根据选择压力以及癌细胞的异质性,有可能出现EGFR低表达/无表达的癌细胞变异株,有较多的机会躲过T细胞的扫荡,形成免疫?#21491;?#26666;。不过能否增殖成为肿瘤的主流,还要看其他因素。比如是否同时存在其他抗原激活的过继免疫应答,有否遭遇固有免疫效应细胞如NK细胞和巨噬细胞,等。随着新靶抗原CART的不断开发,我们还会有更多的选择,例如以HER2、CEA、PDL1、VEGFR等为靶点的CART。一般一个癌细胞增殖到一公分大小要5-10年时间。5年后,一定会有更神奇的抗癌药、抗癌疗法问世。

展望

?#27605;翪ART研究?#28982;?#26397;天,包括寻找新靶抗原,CAR抗体结构的优化设计,基于安全性?#21058;?#30340;多靶点T细胞技术,第4代细胞免疫技术CART(如在CAR结构的基础?#24076;?#22686;加表达IL-12的元件),共刺激结构域的组合,趋化因子受体和CAR的组合表达,等。

《科学》预测2015年重要突破之一是联合免疫疗法。联合免疫疗法是目前医学界探讨的焦点。将多种疗法混合搭配:例如,整合两种新的免疫疗法例如CART和免疫检查点抑制剂的联合,或是联合一种免疫疗法与一种靶向药物例如CART和小分子靶向药物的联合、以及CART与放射疗法或化学疗法相结合。但联合免疫疗法的潜在毒性依然是一个值得关注的问题。

那么,对癌症患者及家属说一句:利用靶向药延长生存期,等待真正的革命性治疗出现。坚?#24535;?#26159;胜利!谁活着谁就看得见!


【1】 Inside, outside, upside down: damage-associated molecular-pattern molecules (DAMPs) and redox, Trends in Immunology 28, 429-436, 2007.
【2】 The Danger Model: A renewed sense of self, Science, 296, 301-305, 2002.
【3】 Genentech’s challenge to the classical hypothesis on immune evasion, Nature, 515(7528), 563-567, 2014.
【4】 https://clinicaltrials.gov/ct2/r ... t&Search=Search
【5】 http://en.wikipedia.org/wiki/Chimeric_antigen_receptor
【6】 非小细胞肺癌的EGFR表达与EGFR基因突变的比?#24076;?中国实验诊断学, Vol 13, No.2, 2009.

(本文原作者elexujx)

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